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Éditorial : Familles bactériennes


 

On entend souvent dire, lors des examens, qu'il n'y a plus de famille, sauf les Enterobacteriaceae parmi les bactéries…

Ce n'est pas l'opinion de Bergey's et de nombreux bactériologistes.

En effet, nous nous heurtons, de part notre approche phénotypique limitée, à la difficulté majeure de définir les familles, classes, et autres subdivisions car le genre n'est pas non plus très bien cerné. Nous nous heurtons aussi à la volonté de cadrer des notions qui ne peuvent pas l'être et sommes très heureux de pouvoir dire qu'une Entérobactérie est un bacille Gram négatif, de type fermentatif, aéroanaérobie, oxydase -, réduisant les nitrates en nitrites, cultivant sur gélose ordinaire…

Pourtant, chacun sait que cette définition ne peut qu'être fausse, d'une part par les nombreuses exceptions (Plesiomonas oxydase +, Klebsiella réduisant les nitrates en diazote, Yersinia et Shigella ne réduisant pas les nitrates…), d'autre part par une définition fondée uniquement sur des caractères phénotypiques.

Il ne faut pas oublier que les classifications actuelles sont génotypiques et philogénétiques… L'espèce est assez clairement définie (homologie DNA-DNA…) mais les groupes supérieurs se heurtent à l'absence d'une telle approche « rigoureuse ». Il n'empêche que l'étude des DNA des RNA ribosomiaux 16S, de certaines protéines permet de subdiviser le monde bactérien, et que les groupes issus de ces études sont publiés et permettent une approche intéressante de ce monde.

On consultera dans Microbiologie>Souches bactériennes>Orientation le tableau que j'ai extrait du Bergeys manual, et qui rassemble toutes les bactéries intéressant principalement la bactériologie médicale. Il me semble que ce document est particulièrement utile pour que chaque étudiant puisse situer les bactéries utilisées.

 

Il est évident très gênant de s'apercevoir que les Pseudomonas et les Entérobactéries sont très proches et très proches des Staphylococcus, que les Mycoplasmes sont Gram + ou du moins issus de Gram + etc…

 

 


Bonne lecture et n'oubliez pas que la critique s'impose et que des contributions (qui seront identifiées évidemment) seront les bienvenues. Une synthèse sera faire pour faciliter la lecture.


 

 

Kligler, lactose

Kligler-Hajna : problèmes posés par la lecture du Lactose

Lundi, 23 mars 2009

L'utilisation du milieu de Kligler-Hajna reste d'actualité, ou d'habitude dans nos laboratoires, aux côtés des galeries miniaturisées. L'interprétation de sa lecture est complexe mais nécessaire si l'on veut dépasser le stade culinaire en bactériologie. On trouvera l'interprétation que j'en fais dans le Dictionnaire des techniques (CRDP d'Aquitaine).

L'objet de cette page est de montrer "la justesse" de cette interprétation, en attendant bien évidement la démonstration du contraire !

Interprétation de la lecture

Le problème est le lactose puisque le milieu est doublement glucidé : 1 % de lactose et 0,1 % de glucose. Une bactérie fermentant le glucose acidifie la pente qui pourtant devient alcaline quand la bactérie est lactose -. On peut l'interpréter comme une alcalinisation liée à l'utilisation des peptones en aérobiose, alcalinisation par respiration qui n'est possible que si le dioxyde de carbone produit, gaz acide, est évacué au dehors.

Problème rencontré

À l'occasion de la préparation des TP d'examen ,le repiquage du souchier des Salmonella m'a conduit, pour la réalisation du sérogroupage, à ensemencer un Kligler pour chaque souche. Aucun problème sauf pour Salmonella ParaB qui s'avère lactose +. Le sérogroupage (qu'il n'aurait fallu faire qu'avec la certitude d'avoir une Salmonella...) confirme l'étiquette : aucun Citrobacter n'est venu perturber les Salmonella. Heureusement !

Résolution

Si le dioxyde de carbone est en cause, il suffit donc d'ouvrir le tube et d'attendre. Les photographies qui suivent montrent l'évolution de la couleur du milieu.

au départ     à la fin

La pente est donc devenue rouge (assez lentement, le dernier tube n'ayant pu être photographié que le lendemain; habituellement il faut moins de 1 heure).

Quelle est la cause du "dysfonctionnement" ? Bien évidemment, le bouchon était trop vissé (erreur du technicien !).

Regardons donc le bouchon avec, à gauche celui du tube et à droite celui d'autres tubes :

Le bouchon du tube de Salmonella ParaB contenait une petite pastille de caoutchouc assurant l'étanchéité, pastille absente de la plupart de nos tubes, recyclés depuis quelques années... Aucun gaz ne pouvait être échangé entre extérieur et intérieur du tube.

Il me semble donc que l'interprétation donnée soit ainsi corroborée. J'attends donc vos critiques ou d'autres hypothèses pour "avancer" !

 


 

microgalerie

Faire une microgalerie

Dans l'Opéron n°7, j'ai présenté une microgalerie réalisée en microplaque classique (cet article est disponible en copie .jpg dans la rubrique Téléchargements/microbiologie dans le menu Infos).

Le but poursuivi est l'introduction des microméthodes en microbiologie avant l'utilisation de microgaleries commercialisées. Les réactions utilisées ont été vues en macrométhode et sont simplement transférées en microplaque au prix de quelques adaptations (pour ADH, LDC, ODC essentiellement).
Un deuxième but est de tester un ensemble de souches représentatives ici des bacilles Gram négatif. Mélanger Vibrio Aeromonas et Entérobactéries est possible. Étudier plusieurs Entérobactéries devient aisé.

Voici les images réalisées en 2002 des premiers TP :

Galerie bacille Gram - 2002

Composition

A1 : mettre une fraction de disque ONPG

 

A2 : milieu ADH au rouge de phénol et à pH acide

 

A3 : milieu LDC au rouge de phénol et à pH acide

 

A4 : milieu ODC au rouge de phénol et à pH acide

 

A5 : milieu Citrate de Simmons en surfusion

 

A6 : milieu au thiosulfate et au fer III

 

A7 : milieu Urée Tryptophane

 

A8 : milieu Urée Tryptophane

 

A9 : milieu Urée Tryptophane

 

A10 : milieu Clark et Lubs

 

A11 : mettre une fraction de pellicule photo et 100 µL de bouillon nutritif

 

A12 : milieu Hugh et Leifson témoin

B1 : milieu Hugh et Leifson glucosé

B2 : milieu Hugh et Leifson mannitolé

B3 : milieu Hugh et Leifson saccharosé

B4 : milieu Hugh et Leifson maltosé

B5 : milieu Hugh et Leifson lactosé

B6 : milieu au DNA

B7 : milieu nitraté

B8 : milieu NaCl 8 g/L

B9 : milieu NaCl 15 g/L

B10 : milieu NaCl 30 g/L

B11 : milieu NaCl 60 g/L

B12 : milieu NaCl 80 g/L

 

 


Des images


avant

Aspect de la galerie avant l'ensemencement :

introduction des milieux

Ensemencement


après

avant addition de réactifs

 

H2S- Urée - TDA- Indole -

citrate - ODC - LDC - ADH - ONPG (Proteus mirabilis)

 

 

peptones, Hugh et Leifson

Utilisation des peptones et Hugh et Leifson

 

L'utilisation des peptones par les bactéries usuelles est un problème délicat car nombre d'entre nous estiment que cette utilisation n'est qu'aérobie. Je m'inscrits en faux contre cette assertion.

Qu'est ce qu'une peptone ?

Les peptones sont fabriquées par hydrolyse chimique (HCl) ou enzymatique de substrats complexes : viande, soja, levures. Leur composition est complexe mais en général elles contiennent des acides aminés (ou de petits peptides), des facteurs de croissance (coenzymes ou leurs précurseurs), des ions minéraux…
Les peptones de levures, appelées souvent extrait de levure, ne sont que des peptones particulières, obtenues généralement par autolyse.
La composition des différentes peptones varie en fonction de la source et des traitements. Des mélanges de peptones permettent d'équilibrer les différents composants.

Comment la bactérie utilise-t-elle les acides aminés ?

L'image suivante montre la culture en Hugh et Leifson sans glucose d'une entérobactérie.

aérobiose/anaérobiose ?

Le tube de gauche montre clairement la culture bactérienne en anaérobiose : les bactéries en cause utilisent donc les peptones en anaérobiose puisque c'est le seul substrat carboné pour ces hétérotrophes.

métabolisme et lecture des milieux

En aérobiose, les peptones sont respirées : les acides aminés sont donc oxydés en dioxyde de carbone, acide et volatil, et en ammoniac alcalin et très soluble : le milieu sera alcalinisé puisque le dioxyde de carbone va sortir du tube. Le milieu sera alcalinisé (bleu ici)

En anaérobiose, les peptones sont fermentées : les acides aminés sont transformés en acides organiques, alccols,... acidifiants et non volatils, et en ammoniac toujours alcalinisant et soluble. Le milieu va donc rester neutre (vert ici).

autres milieux

La même observation peut être faite dans tous les milieux contenant peptones et glucides. C'est le cas de Kligler, LDC-ODC-ADH, Lysine -fer, etc... On doit bien sûr alors tenir compte des autres constituants du milieu !


Galerie API20 E, quelques couleurs…

ADH, LDC, ODC, CIT ; de l'importance de la vaseline

Lors d'une situation d'évaluation de CCF, une étudiante a commis une erreur d'ensemencement de sa galerie API20E. Elle inversa la vaseline entre encadré et souligné… S'apercevant de son erreur, elle ensemença une nouvelle galerie…

Voici l'image comparée des deux galeries : 

Remarquons que tous les tubes normalement vaselinés sont alcalins (rouges) et que le citrate (de Simmons) est vert alors que
dans la deuxième galerie, les couleurs sont différentes (avec une petite ambiguïté sur ADH par remplissage un peu trop important de la cupule).

C'est l'utilisation des peptones (peptone de levure peut être) qui cause l'alcalinisation au lieu de la décarboxylation de l'acide aminé. Pour que celle-ci soit visible, il faut absolument que le CO2 soit conservé dans la cupule et que l'utilisation des peptones soit anaérobie (fermentation) : alors le CO2 maintient l'acidification de départ alors que la fermentation des peptones n'agit pas sur le pH (l'ammoniac produit est neutralisé par les acides de fermentation). Mais, si la souche dispose d'une décarboxylase (ou une ADH), alors l'alcalinisation pourra se développer.

La même interprétation peut être faite pour Citrate de Simmons : il faut absolument que le CO2 produit s'échappe pour que l'alcalinisation apparaisse : elle est nette dans la partie ouverte du tube…

La souche est Klebsiella oxytoca (le réactif de Kovacs n'est pas encore mis).


Ure chez une bactérie Uréase - (Enterobacter cloacae)

 

 On remarquera une coloration jaune en bas et rouge en haut…

Manifestement, la quantité de vaseline fut insuffisante pour ce tube : l'alcalinisation superficielle est probablement liée au départ du CO2… (ce que l'on n'observe pas en milieu Urée Tryptophane (Indole) classique.

 


H2S chez Citrobacter freundii

 

Curieusement, une de nos souches de Citrobacter freundii donne le résultat ci-contre : le précipité de sulfure de fer III n'apparait pas de façon massive comme avec d'autres souches H2S +.

D'ailleurs nos différentes souches de  Citrobacter freundii appparaissent H2S - en Kligler la plus souvent.

 


Une surprise…

Encore une chose étonnante !

Essayez de faire cela…

 

solution au prochain numéro

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