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3. généralités sur virus animaux

étude des virus des cellules eucaryotes (généralités)


La première étape de l'étude virologique c'est l'obtention de virus. Sa multiplication étant intracellulaire, la culture sera réalisée sur culture de cellule ou sur un organisme entier, embryonnaire ou non.

1. obtention des virus : la culture de virus et leur purification

1.1. culture virale

Elle nécessite des cellules qui seront infectées et détruites par le virus en multiplication.

Ces cellules pourront être des cellules en culture, des cellules d'oeuf embryonné ou des cellules d'un animal entier et vivant.

Elles sont généralement spécifiques du virus. Il existe de nombreux virus que l'on ne sait pas aujourd'hui cultiver comme les papillomavirus, certains virus d'hépatites , ou qui sont de culture particulièrement fastidieuse (HIV, rotavirus...). D'autre part la culture peut être extrêmement dangereuse (virus des fièvres hémorragiques, HIV...).

  • Culture sur oeuf embryonné

 

      Les oeufs sont embryonnés de 5 à 10 jours (c'est à dire fécondés ce qui satisfait le coq et la poule)

      Divers lieux peuvent être utilisés pour l'ensemencement :
  • membrane chorioallantoïdienne Poxvirus, Herpesvirus
  • cavité amniotique Myxovirus influenzae A, B, C
  • cavité allantoïdienne Myxovirus influenzae
  • sac vitellin Herpes virus, Arbovirus

Une fois ensemencés, les oeufs sont mirés chaque jour. Ceux dont les embryons sont morts sont éliminés. Quand le temps d'incubation est jugé idoine, on récupère le contenu des cavités inoculées et on purifie.

 

 

  • Culture sur animaux

    Cette méthode reste la seule possible pour certains virus incultivables in vivo et pour les études sur les vaccins. Dans certains cas, comme HIV, les animaux doivent être très proches de l'homme : on est contraint alors de choisir le chimpanzé.
    On utilise aussi les souriceaux, les cobayes, les lapins, les oiseaux (poulets)
    Pour la rage Pasteur a utilisé la moelle de lapin : le lapin est donc resté bien longtemps le "milieu de culture" de ce virus.
    Le virus de la vaccine (vaccin contre la variole) reste produit sur génisse. (voir photo)

  • Culture sur cellules en culture
    Les virus sont ajoutés sur les cellules en culture et se multiplient. Il suffira ensuite de les purifier. Cette solution évite le recours à l'animal, facilite généralement la purification, est relativement plus facile à mettre en oeuvre.

1.2. purification

Essentielles aux études biochimiques, la purification est très importante pour les vaccins, en particulier pour éviter de mettre des protéines d'origine oeuf dans le vaccin (grippe).

La purification comprend toutes les phases classiques d'une purification en biochimie après la lyse des cellules :

  • précipitations d'éléments indésirables par solvants, sels, décongélation-congélation, thermocoagulation…
  • des centrifugations et des ultracentrifugations
  • des chromatographies diverses et en particulier d'affinité.

Une fois les virus purifiés, ils peuvent être utilisés pour :

  • leur étude biochimique
  • leur identification (par les antigènes, par l'effet pathogène…)

1.3. remarque

L'essentiel de la culture virale est la reproduction de l'acide nucléique.

On peut réaliser l'intégration de l'acide nucléique viral dans le DNA d'une cellule dont la multiplication permettra l'amplification simple ou réaliser des amplifications classiques de DNA de type amplification génique (PCR par exemple).

La reconstitution du virion à partir de l'acide nucléique n'est pas exclue : il suffit que les protéines virales puissent être produites par l'acide nucléique dans un système cellulaire.


2. composition chimique des virus

2.1. protéines

Un certain nombre de protéines accompagne l'acide nucléique.
Ces protéines sont des protéines de structure et des enzymes.

2.2. lipides

Les virus enveloppés possèdent des lipides constituant l'enveloppe, c'est à dire des phospholipides. Ils appartiennent à la cellule hôte plus qu'au virus...

2.3. acide nucléique

Les virus ne contiennent qu'UN SEUL TYPE D'ACIDE NUCLÉIQUE : RNA ou DNA, rarement circulaire (HBV) donc généralement linéaire, et très rarement morcelé (9 fragments chez le virus grippal).

De plus, cet acide nucléique peut être MONO ou BICATÉNAIRE (aussi bien pour RNA que DNA). On trouve même des structures mixtes (partiellement bicaténaires) chez le HBV.

Ce génome est RÉDUIT : on trouve 8 gènes chez les parvovirus et 400 chez les poxvirus.

Masse molaire des génomes de virus à DNA :

3 Mg.mol-1 : DNA monocaténaire de phage
160 Mg.mol-1 : poxvirus

Masse molaire des génomes de virus à RNA :

1 Mg.mol-1 : petits phages à RNA
10 Mg.mol-1 : oncovirus
15 Mg.mol-1 : reovirus

(à comparer avec le génome d'E. coli : 9 000 Mg.mol-1 ou de Mycoplasmes 500 Mg.mol-1.

Ce génome ne peut s'exprimer que dans une cellule hôte parce qu'il est trop réduit pour s'autosuffire (ce que l'on retrouve chez des bactéries comme les Chlamydiae). La synthèse d'ATP est en particulier impossible pour le virus isolé.

Cette expression passe par la synthèse de RNA messagers pour les virus à DNA, puis synthèse des protéines.

Pour les virus à RNA monocaténaire on a deux situations :

  • le RNA est lui même un RNA messager (polarité positive)
  • le RNA doit être transcrit pour donner un RNA messager (polarité négative)

3. ultrastructure des virus

C'est l'invention du microscope électronique qui nous permet de VOIR les virus pour la première fois.

Les virus sont des structures relativement simples, presque cristallines. On peut alors distinguer trois grands types en fonction de la symétrie de la structure observée :

  • des virus en bâtonnet à structure dite hélicoïdale
  • des virus de forme cubique à structure dite icosaédrique
  • des virus mixtes plus complexes : les bactériophages à queue

Cette symétrie peut être masquée, pour les deux premiers, par l'enveloppe qui entoure la structure de base.

3.1. nucléocapside à symétrie hélicoïdale

Le modèle majeur de ce type de virus est le MTV ou virus de la mosaïque du tabac, virus très écologique.

Il est formé d'une baguette cylindrique creuse ressemblant fortement à un flagelle bactérien ou un microtubule eucaryote, de 300 µm de long et de 17 nm de diamètre.
Cette baguette inclue un RNA de M = 2 Mg.mol-1
Elle est constituée d'une seule protéine de M = 17 500 g.mol-1. Ce monomère est répété 2200 fois dans un virus et forme l'hélice à raison de 16,3 protéines par tour d'hélice.
Jusqu'en 1960 aucun virus hélicoïdal animal n'était connu. En effet, ces virus sont toujours enveloppés et l'hélice est, de plus, peu rigide ce qui conduit à une structure globulaire les faisant confondre avec les virus à symétrie cubique.
Ces virus sont ceux de la grippe, les myxovirus, les paramyxovirus.

3.2. nucléocapside à symétrie cubique

La forme de la capside est icosaédrique.

L'icosaèdre est un volume (polyèdre) formé de 20 faces égales formées d'un triangle équilatéral. Il possède 12 sommets et 30 arêtes.

Cette capside est formée par l'assemblage d'unités morphologiques appelées CAPSOMÈRES :

  • 252 capsomères pour un Adénovirus
  • 70 capsomères pour un Poliovirus.

Au niveau des sommets les capsomères s'assemblent en pentamères (ou pentons)

Au niveau des faces et des arêtes les capsomères s'assemblent en hexamères (ou hexons)

Les capsomères ont souvent la forme de prismes creux avec un canal axial cylindrique.

À l'intérieur de la capside, on trouve :

  • l'acide nucléique (éventuellement plusieurs molécules)
  • des protéines internes le plus souvent basiques

L'ensemble est appelée nucléoïde du virion ou core.

 

3.3. enveloppes virales

L'enveloppe virale est de nature membranaire : elle contient des phospholipides, des protéines, ces deux structures portant des polyosides.

Cette enveloppe est située en périphérie du virus : elle est donc le support essentiel des épitopes viraux.

La membrane constituant l'enveloppe peut avoir plusieurs origines différentes dans la cellule selon le lieu où le virus emprunte la membrane de la cellule hôte :

  • enveloppe nucléaire (Herpès virus)
    L'assemblage viral se fait dans le noyau. Le virus enveloppé sort alors du noyau pour aller dans le cytoplasme avant se sortir.
  • membranes du Réticulum endoplasmique (RE) ou du Golgi (Coronavirus, Togavirus virus de la rubéole)
    L'assemblage viral se fait dans le cytoplasme au niveau des systèmes membranaires un peu comme pour les protéines emballées des cellules excrétrices. Le virus enveloppé s'accumule alors dans des vacuoles
  • membrane plasmique (Myxovirus, Rhabdovirus, virus grippal)
    L'assemblage viral se fait dans le cytoplasme et le virus s'enveloppe au moment de sa sortie par bourgeonnement.

La membrane constituant l'enveloppe possède des caractéristiques de la membrane d'origine mais est très souvent modifiée par le virus : des protéines virales sont intégrées dans la membrane comme l'hémagglutinine, la neuramidase… qui apparaissent souvent sous forme de spicules à la surface de la membrane et dont les fonctions servent à l'attachement ou au détachement du virus.

Les enveloppes sont en général fragiles vis à vis de ka chaleur ou des tensioactifs comme le dioxyde d'éthyle (éther), les sels biliaires, les détergents. Il y a une EXCEPTION : le le virus de l'hépatite B (HBV) qui s'avère résistant à de nombreux agents : sa manipulation en particulier par l'intermédiaire de sang infecté, suppose donc des précautions particulières.

Les virus enveloppés ne sont jamais retrouvés dans les selles puisque les sels biliaires les détruisent. La grippe intestinale n'existe pas puisque le virus de la grippe est enveloppé. Cette dénomination absurde doit être traduite en gastroentérite virale due à de nombreux virus.


4. définition des virus

Contrairement à l'apparence, définir le terme virus n'est pas simple. Comme d'ailleurs savoir s'ils sont vivants ! (voir 9. Virus et vie)

définition de Wolf (1957)

  • un virus contient un seul type d'acide nucléique : ADN ou ARN
  • l'information génétique portée doit être décodée par une cellule
  • le virus nécessite pour son développement un parasitisme intracellulaire absolu
  • ils possèdent une structure spécifique qui les opposent aux autres vivants à structure cellulaire, c'est à dire aux cellules pro et eucaryotes

On prendra garde au fait que certaines bactéries sont parasites intracellulaires absolus (Chlamydiae, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum…). Elles contiennent toujours DNA et RNA.

définition proposée

Un virus présente les caractéristiques suivantes :

  • il ne contient qu'un seul acide nucléique, soit RNA soit DNA.
  • c'est un parasite intracellulaire obligatoire car incapable de participer au métabolisme énergétique (aucun enzyme du métabolisme n'est produite en particulier pour la synthèse des protéines), détournant l'expression génétique de la cellule hôte.
  • il possède un mode particulier de multiplication diffèrent de la mitose ou de la multiplication bactérienne comprenant un parasitisme du DNA de l'hôte.
  • il est de petite taille (inférieure à 0,30 µm environ) et passe au travers des filtres 0,22 µm.
  • il présente une structure pratiquement cristalline donc particulièrement bien définie. Cette structure n'est pas cellulaire, c'est à dire que même entourée d'une membrane enveloppe, on ne peut pas considérer qu'il s'agisse d'une cellule.

Définition trouvée sur internet : (http://www.citeweb.net/viro/viro)

Les virus sont des entités avec des génomes constitués d'élément d'acide nucléique qui se répliquent à l'intérieur de cellules vivantes en utilisant le machinerie de synthèse cellulaire pour la synthèse d'éléments spécialisés appelés VIRIONS qui sont capables de transférer leur génome à d'autres cellules (virion = particule virale).

Remarque : les virus affectant l'homme sont constitués de gènes très proches des gènes des cellules humaines (et non des gènes bactériens)

Remarques

Les virus atteignent toutes les cellules eucaryotes ou procaryotes. On divise donc le monde des virus en fonction des hôtes avec :

  • les virus animaux (avec les virus de vertébrés et les virus des invertébrés)
  • les virus végétaux
  • les virus des champignons
  • les virus des protozoaires
  • les virus des procaryotes ou bactériophages

Certains virus, comme certains parasites animaux, se partagent entre une vie chez l'animal vertébré et une vie chez l'insecte vecteur. (fièvre jaune, etc...) Ils ont peut-être alors un rôle dans les échanges de DNA entre espèces.

On ne considère pas comme virus des RNA seuls (viroïdes végétaux), ni d'autres acides nucléiques capables de multiplication ou d'infection. (plasmides, transposons) ni les prions (considérées actuellement comme des protéines infectieuses).

5. classification des virus

Elle est basée sur quatre principaux critères depuis 1960 (classification de LWOFF, HORNE et TOURNIER) :

  • nature de l'acide nucléique (DNA ou RNA)
  • symétrie de la nucléocapside (Hélicoïdale ou Cubique )
  • présence d'une enveloppe (Enveloppé ou Non enveloppé (virus nu) )
  • nombre de capsomères (virus C) ou diamètre de la nucléocapside (virus H)

Depuis 1975, un comité international classe en famille / sous famille / genres / espèce

Famille Acide nucléique Taille (nm) symétrie et enveloppe genre exemples de virus
Adenoviridae ADN 70-90 nm cubique

non enveloppé

Adénovirus conjonctivites et rhumes
Papovaviridae ADN 45 nm cubique

non enveloppé

Polyomavirus

Papillomavirus

Virus BK et JC

Virus des papillomes (verrues, condylomes génitaux)

Herpesviridae ADN 150-200 nm cubique

enveloppé

Herpesvirus virus Herpes simples
Virus Varicelle-Zona
Cytomegalovirus
Virus d'Epstein-Barr (MNI)
Poxviridae ADN 200 x 300 nm complexe

enveloppé

Poxvirus Virus de la Variole
Virus de la Vaccine
Virus du Molluscum contagiosum
Hepdnaviridae ADN

(circulaire)

40 nm cubique

enveloppé

Hepadnavirus Virus de l'hépatite B
Parvoviridae ADN

(monocaténaire)

20 nm cubique

non enveloppé

Parvovirus Virus B19 (homme : tableau de rubéole)
Picornaviridae ARN + 20-30 nm cubique

non enveloppé

Enterovirus

Hepatovirus

Rhinovirus

Poliovirus
Coxsackie virus A et B
Echovirus
Enterovirus 68-71
Virus de l'hépatite A
Virus de rhumes
Caliciviridae ARN + 40 nm cubique

non enveloppé

Calicivirus Virus de Norwalk (gastroentérites)
Coronaviridae ARN + 80-120 nm hélicoïdale

enveloppé

Coronavirus (rhume, gastroentérites)
Togaviridae ou Flaviviridae ARN + 40 nm cubique

enveloppé

Flavivirus

Alphavirus

Rubivirus

Hepcivirus

Virus de la fièvre jaune

Virus de la dengue

Virus de la rubéole

Virus de l'hépatite C

Reoviridae ARN

(double brin segmenté)

60-80 nm cubique

non enveloppé

(double capside)

Reovirus

Rotavirus

gastroentérites

Orthomyxo-viridae ARN - (segmenté) 80-120 nm hélicoïdale

enveloppé

Influenzavirus Virus de la grippe
Paramyxoviridae ARN - 150-300 nm hélicoïdale

enveloppé

Pneumovirus

Paramyxovirus

 

Morbillivirus

Virus respiratoire syncitial

Virus parainfluenza

Virus des oreillons

Virus de la rougeole

Rhabdoviridae ARN - 60 x 180 nm hélicoïdale

enveloppé

Lyssavirus

Vésiculovirus

Virus de la rage

Virus de la stomatite vésiculeuse

Filoviridae ARN - 80 x 850 nm

enveloppé

Filovirus virus d'Ébola

Virus de Marbourg

Bunyaviridae ARN -

(segmenté)

90-120 nm cubique

enveloppé

Bunyavirus

Phlebovirus

Nairovirus

Hantavirus

virus de la fièvre de la vallée du Rift

virus de la fièvre hémorragique Crimée-Congo

virus Hantaan (fièvre hémorragique)

Arenaviridae ARN - 50-300 nm ?

enveloppé

Arenavirus Virus de la chorioméningite lymphocytaire

Virus de Lassa

Retroviridae ARN 100 nm ?

enveloppé

Oncornavirus

Lentivirus

Virus oncogènes à ARN (HTLV)

Virus HIV

 

6. introduction à l'étude des cycles

Dans un premier temps doit se dérouler le contact entre le virus, libre au dehors, donc exposé directement au système immunitaire, et la cellule qu'il infecte.

Il y aura donc :

o fixation du virus sur un récepteur spécifique de la membrane externe de la cellule

o pénétration virale selon différents modes :

  • pour les virus nus : phagocytose puis transfert vers d'autres compartiments cellulaires ou libération dans la cytoplasme
  • pour les virus enveloppés:
    • fusion de l'enveloppe virale avec la membrane puis libération de la nucléocapside dans le cytoplasme
    • phagocytose du virus puis fusion avec la membrane de la vacuole et libération cytoplasmique

o actions du virus qui dépendent de la cellule. En effet, les interactions entre le virus et la cellule infectée peuvent être de plusieurs ordres :

  • interaction productive : de nombreux virus sont produits
  • interaction abortive : la cellule ne produit pas de virus, soit parce qu'il n'y a pas de pénétration, soit parce que la cellule s'oppose aux mécanismes mis en place par le virus, soit parce que la cellule meure avant que le virus ne se soit multiplié. (cellules non permissives)
  • interaction intégrative : le génome viral s'intègre au DNA cellulaire, soit dans les molécules de DNA, soit comme épisome.

S'ajoutent évidemment les réactions de l'hôte ou de la cellule hôte qui influent sur le cycle viral.

Pour "voir" les différents cycles possibles, vous pouvez suivre le plan suivant :

  • cycle d'un virus à RNA positif nu : poliovirus
  • cycle d'un virus à RNA négatif enveloppé : virus grippal
  • cycle d'un virus à DNA bicaténaire : herpèsvirus
  • cycles de virus atteignant le foie : hépatites
  • cycle d'un rétrovirus (à RNA) : sida