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5. Diagnostic des viroses

diagnostic des viroses


(NE PAS OUBLIER QUE LE PUBLIC CONCERNÉ EST LES TECHNICIENS DE LABORATOIRE ET QUE L'AUTEUR N'EST PAS MÉDECIN !!!)

L'examen clinique, avec la fièvre, les pustules, les rougeurs et bien d'autres signes, est, dans le cas des viroses, d'une grande importance et très souvent suffisant. Le rapprochement avec les épidémies en cours confirme alors le diagnostic.
Il faut parfois aller plus loin et nommer ou identifier le virus en cause pour :

  • Affirmer son rôle effectif dans la pathologie rencontrée. C'est particulièrement important dans le cas de patients pour lesquels les viroses sont graves ou peuvent être graves (personnes âgées, immunodéprimés, patients atteints de SIDA, greffés ou futurs greffés, nourrissons nés de mères porteuses de virus), ou pour la détection chez des porteurs asymptomatiques. Dans ce cas il y a lieu de procéder à la recherche virale dans le prélèvement biologique adéquat et de réaliser un prélèvement de sérum qui sera conservé par congélation pour que l'analyse réalisée 15 jours plus tard puisse comparer les taux sériques des Anticorps recherchés.
  • Permettre la conduite d'opérations prophylactiques collectives ou individuelles (cas de la rubéole pour les femmes enceintes, de nombreux virus en cas de greffe ou de transfusion, de la poliomyélite, du sida...).
  • Permettre la conduite du traitement et donner un pronostic de l'affection.
  • Surveiller une épidémie (identification du virus et découverte éventuelle de nouveaux virus comme le SARS) et préparer les vaccins utiles (cas de la grippe).

Comme pour toutes les infections, nous disposons de deux moyens fondamentaux :

  • Examen direct classique : mise en évidence d'un virus ou de l'un de ses constituants dans un produit pathologique.
  • Examen indirect rapide : titrage des Ac antiviraux apparus dans le sang à la suite de l'infection.

1. Mise en évidence directe des virus ou de leurs produits

Différentes méthodes permettent la mise en évidence des virus. N'oublions pas l'importance de la sécurité dans la manipulation.Le prélèvement doit être de qualité et adapté aux techniques : pour la fluorescence les cellules ne doivent pas être altérées par la congélation, pour la culture mieux vaut aller très vite ou congeler sauf pour certains virus comme le CMV, pour la biologie moléculaire aussi la vitesse est importante afin d'éviter l'action rapide des RNAses.

Sécurité

La manipulation de virus par les laborantins impose, comme c'est le cas pour tous les produits pathologiques, des précautions importantes, tout particulièrement en cas de culture du virus, la quantité étant alors importante. Certains virus nécessitent l'utilisation d'installations de sécurité particulière type L3 ou L4 (NSB3 ou NSB4 pour els niveaux de sécurité).
Les virus courants seront manipulés sous Poste de sécurité microbiologique avec port de gants, de masque et de lunettes. La lutte ainsi réalisée contre les aérosols est ici très importante. Il ne faut toutefois pas exagérer les risqeus encourus dans le cadre d'une manipulation responsable.

Utilisation du microscopie électronique

La microscopie électronique est rarement utilisée en pratique courante mais c'est parfois la seule possibilité de mise en évidence de virus et c'est la base du diagnostic en recherche fondamentale.
La résolution est de l'ordre du nm.

Il est nécessaire de préparer l'échantillon à observer par "coloration", généralement réalisée par des métaux lourds comme l'or, le tétraoxyde d'osmium, l'acétate d'uranyle.

Utilisation : mise en évidence de virus des gastroentérites, de pox-virus, de Molluscum contagiosium, d'herpesvirus chez les immunodéprimés…

Utilisation de techniques immunologiques

Des anticorps peuvent être fabriqués contre des virus par vaccination ou par culture d'hybridomes. On dispose d'un certain nombre de ces anticorps qui permettent, grâce à la spécificité de leur action, une mise en évidence rapide de virus dans un produit biologique. Il est parfois possible de ne mettre en évidence qu'une partie (un antigène) du virus (voir Hépatite B).

Les techniques utilisées sont basées sur la mise en évidence de la réaction par immunoenzymologie, immunochromatographie, par immunofluorescence ou à l'aide de particules de latex sensibilisées. La chimiluminescence est aussi utilisée.

immunoenzymologie très nombreux virus... (hépatites, HIV...)
immunochromatographie : à déterminer…
immunofluorescence nombreux virus respiratoires
latex sensibilisés Rotavirus dans les selles

Utilisation de techniques de biologie moléculaire

L'amplification du génome est la seule technique applicable dans certains cas (hépatite C) ou une technique très efficace dans d'autres (hépatite B, SIDA, CMV, HHV8, VZV, EBV, Entérovirus, Papillomavirus…).
Elle peut être quantitative (PCR en temps réel) et permettre un typage viral.
Pour cela il faut disposer d'AMORCES constituées de brins de DNA courts et spécifiques du DNA recherché et du protocole adapté. Une fois l'amplification réalisée, la mise en évidence du DNA cible recherché sera réalisée par l'addition d'une SONDE spécifique si possible différente des amorces. Pour les virus à RNA, une étape de transcription inverse permet de suivre la même méthode.

Dans le cas des HPV (Human Papillomavirus), deux sondes permettent le typage : l'une détecte les types viraux associés au cancer de l'utérus (16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 56) et l'autre les types bénins (6, 11, 42, 43, 44).

L'amplification génique devient la technique de choix de la virologie de par son faible seuil de détection, la possibilité de quantifier, sa rapidité de mise en oeuvre.

Utilisation de la culture puis de la mise en évidence des effets cytopathogènes

La réalisation de l'isolement viral sur culture cellulaire est une opération délicate, longue (2 à 21 jours), parfois dangereuse. Elle nécessite un laboratoire très organisé et du personnel très compétent. Le respect des procédures est essentiel à l'efficacité de la recherche. Elle reste la technique de référence mais les difficultés évoquées de sa mise en œuvre limitent considérablement son utilisation en routine.

La culture est réalisée essentiellement sur culture de cellules sauf
- pour la grippe dans les laboratoires de référence, qui utilisent un œuf embryonné de 10 jours,
- pour le diagnostic d'infections à Coxackies virus A et B utilisant l'injection intracranienne à des souriceaux nouveau-nés.

le prélèvement

C'est la première opération, et une des plus importante puisque sa qualité, comme toujours en biologie, conditionne la suite. Pour le recueil des prélèvements :

  • les écouvillonnages réalisés pour récupérer les sécrétions respiratoires (nasales ou trachéo-bronchiques ou bronchiques), conjonctivales, les ulcérations sont introduits dans un milieu de transport semi-mou : gélose Charbon.
  • les aspirations et sérosités des sécrétions respiratoires, les urines sont recueillies dans du Hank's
  • les selles recueillies sont introduites dans un flacon stérile et l'addition de milieu de transport n'est pas obligatoire.

Quant au transport des prélèvements, il convient de les transmettre rapidement, toujours au froid (4°C) dans des conditionnements spéciaux. La fiche de renseignements est essentielle pour orienter les recherches virales. Elle comprendra l'âge du malade, la nature des produits pathologiques recueillis, le délai écoulé entre le début des symptômes et la récolte des échantillons, le ou les syndromes cliniques observés.

cultures

Les cultures sont réalisées en tubes sur cellules MRC5 (culture de nombreux virus sur ces cellules en lignée semicontinue provenant de fibroblastes embryonnaires de poumon) ou sur cellules VÉRO, HÉLA,...
Un traitement préalable de l'échantillon peut permettre une décontamination microbienne. Les milieux de culture sont additionnés d'antibiotiques antibactériens et antifongiques si nécessaire.

lecture des tubes, lames ou boîtes ensemencés et exemples

Elle se fait au microscope inversé en recherchant les modifications morphologiques des cellules spécifiques d'un virus ou d'une famille de virus, autrement dit en recherchant l'effet cytopathogène ou ECP (ou cytopathique).
Les différentes anormalités à voir sont :

  •  la formation de syncytiums (cellules plurinucléées)
  •  arrondissement cellulaire
  •  réfringence cellulaire
  •  l'agrégation des cellules infectées, réfringentes, souvent détachées
  •  la présence de vacuoles
  •  la place de la chromatine dans le noyau et son aspect
  •  etc...

Quelques exemples d'effets cytopathogènes :

1- Cas de l'Herpes virus simplex ( HSV ) ou du CMV

À l'examen direct ou Après coloration
augmentation de taille
déformation de la cellule contenant plusieurs noyaux (sur cellules Véro ) .
cellules réfringentes groupées en amas ( grappe de raisin et se détachant du tapis cellulaire ) Cellule avec inclusion virale éosinophile intranucléaire. La chromatine est repoussée en périphérie groupée en mottes, tout l'intérieur du noyau étant occupé par les inclusions virales.

Ci-dessous : cellules MRC5 normales (à gauche) - cellules infectées par le CMV (à droite)

2- Cas de l'Adénovirus

À l'examen direct ou Après coloration
attaque uniforme du tapis cellulaire et rétraction du cytoplasme induisant un maillage du tapis cellulaire donnant un aspect en filet de pêche sur cellules Véro
cellule avec inclusion centro-nucléaire basophile avec tout autour des inclusions virales éosinophiles conférant au noyau un aspect en cible , d'où le nom de cellule en cible

3- Cas de l'Entérovirus

À l'examen direct Après coloration
attaque uniforme du tapis cellulaire
cellules infectées diminuées de taille cellule avec inclusion virale éosinophile intracytoplasmique refoulant le noyau apparaissant basophile à la périphérie. On parle de cellule à noyau en béret basque

conclusion

L'isolement du virus est en faveur du diagnostic d'infection virale.
Mais si le résultat est négatif, on ne peut pas exclure totalement l'intervention d'un virus car :
 - l'isolement peut être techniquement difficile à réaliser (virus de la rubéole, de la rougeole, adénovirus)
 - le prélèvement a pu être réalisé trop tardivement après le début de la maladie (ceci est surtout fréquent chez l'adulte)

typage viral

L'identification peut être précisée par typage. Dans ce cas, on utilise souvent la neutralisation de l'effet cytopathogène par l'utilisation d'anticorps ajoutés au milieu ou traitant au préalable la culture virale.

génotypage viral

Les virus sont souvent très variables : le séquençage de l'acide nucléique peut permettre l'identification des génotypes (voir HIV, HBV…).


2. mise en évidence ou titrage des anticorps

Le diagnostic immunologique direct ou indirect est évidemment le plus utilisé en raison d'avantages importants :

  • résultat exploitable quelques heures après la demande de l'examen
  • technique de réalisation économique
  • nécessité d'aucune précaution particulière de recueil ou de transport des échantillons de sang ou de sérum.


Il faut souvent, pour un diagnostic viral, faut faire deux titrages :

  • titrage sur un échantillon recueilli précocement
  • titrage sur un échantillon recueilli tardivement et comparer les deux résultats.

Plusieurs techniques peuvent être mises en jeu :

  • neutralisation de l'ECP du virus : les Ac sériques éventuellement présents, mélangés à la suspension virale, neutralisent l'ECP d'une culture virale (en oeuf embryonné, sur animal entier ou sur culture de cellules) en empéchant la pénétration du virus par l'agglutination. Technique lourde et coûteuse.
  • fixation du complément (Ac + Ag viraux et complément : activation du complément puis addition d'hématies de mouton recouvertes d'Ac anti hématies de mouton (sensibilisées) dans des conditions non agglutinantes. Si le complément est activé (présence d'Ac) il ne peut plus être activé et ne peut donc lyser les hématies. Si le complément n'est pas activé, il peut l'être par les complexes hématies-Ac antihématies et il y a hémolyse)
  • inhibition de l'hémagglutination (voir sérodiagnostic de la rubéole)
  • immunofluorescence
     
  • immunoenzymologie et l'immunochromatographie techniques de choix aujourd'hui