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2. Modèle du bactériophage

les bactériophages ou virus des bactéries

Les bactériophages sont les virus des bactéries.
Leur étude est simple parce que les cellules concernées sont de culture simple et rapide.
On étudiera ici le bactériophage comme modèle de l'infection virale et on se limitera au bactériophage T qui atteint E.coli.

1. culture des bactériophages

Cultiver des bactériophages c'est d'abord cultiver des bactéries. Deux situations permettent de mettre en évidence ces bactériophages qui attaquent les bactéries :

1.1. mise en évidence : les plages de lyse

Si l'on dispose d'une suspension de phages, il est simple de mettre en évidence l'attaque sur un tapis bactérien. On réalise une culture bactérienne comme pour l'antibiogramme. On dépose ensuite les phages. Après incubation on observe :

On peut donc voir sur les boîtes les PLAGES DE LYSE (voir photo ci-dessous).

De plus, ces plages n'apparaissent pas sur toutes les boîtes : en effet, il y a une certaine spécificité entre bactérie et phage. Ici le phage attaquant Bacillus anthracis n'attaque pas toutes les bactéries mais seulement les 1 et 2. On peut donc utiliser les phages pour IDENTIFIER. Deux sont commercialisés pour distinguer les Salmonella H2S - des Hafnia.

1.2. titration des phages

La suspension de phage peut être numérée : on pourra compter les phages en comptant le nombre de plages de lyse si on DILUE la suspension.

<Titration d'un bactériophage (bactériophage anti-Salmonella)>

On constatera que la dilution 10-6 révèle une quarantaine de plages de lyse quelque peu confluentes et que la dilution 10-7 révèle 5 plages de lyse, alors que la dilution 10-8 n'en révèle qu'1.
Il y a donc dans 1 cm3 de suspension phagique = 5 milliards de phages.

2. structure et composition des bactériophages T

Il existe de nombreux bactériophages de formes et de physiologie différentes. On se contentera ici du bactériophage T. L'observation des phages impose évidemment le microscope électronique.

<image du bactériophage éclaté>

Le choc osmotique révèle une macromolécule très importante dans le bactériophage central : c'est le DNA linéaire qui a été expulsé.

<image des phages classiques (Berkaloff)>

 

Le phage de type T présente une structure relativement complexe avec une tête, une queue, et des fibres caudales. Taille de l'ordre de 0,2 µm (200 nm)

Les différents éléments externes sont de nature protéique.

Le DNA est inclus dans la tête entouré donc par les protéines.

 

 

 

3. le cycle de multiplication du bactériophage T

3.1. Étape : fixation du phage sur la bactérie

  • expériences de Hershey et Chase
    Par culture sur des substrats radioacifs on "fabrique" des phages marqués d'une part par du 32P (Phosphore 32) au niveau de leur DNA, et d'autre part par du 35S (Soufre 35) au niveau de leurs protéines
    On ajoute les phages à une culture bactérienne puis 10 minutes plus tard on centrifuge puis on détecte la radioactivité :
    • le surnageant est marqué au 35 S
    • le culot bactérien est marqué au 32 P.

      L'expérience montre la radioactivité phosphore à l'intérieur : le DNA pénètre.
      Par contre la radioactivité soufre reste à l'extérieur démontrant que les protéines virales ne pénètrent pas.
  • Observation 1:
    À deux espèces d'E. coli, on ajoute une suspension de phages T4. L'examen au microscope électronique montre que l'une des souches, qui est sensible, en fixe beaucoup, tandis que l'autre, qui est résistante, n'en fixe pratiquement pas. (les phages vus ne sont peut être là que par la hasard)

    Il y a donc une certaine spécifité entre le phage et la bactérie : des récepteurs spécifiques permettent l'atterrissage du phage !

  • Observation 2:
    <photos montrant deux phages, l'un a la tête pleine et l'autre a la tête vide et est fortement contracté (Berkaloff)>

    On voit donc clairement que la contraction de la gaine caudale provoque l'injection du DNA dans le cytoplasme. Pour percer la paroi il est très certainement nécessaire pour le phage de disposer d'une peptidoglycanase allors que le franchissement de la membrane externe fluide ne pose pas de problèmes.

    Le mécanisme et ses conséquences :

    < schéma >

(dessin issu de http://www.Cellsalive.com/phage.htm )

3.2. Étape : les phénomènes internes

3.2.1. le graphe

 

<graphe>

 

Le graphe analyse :

  • le DNA bactérien
  • le DNA viral
  • les protéines fabriquées par le virus : protéines dites précoces et protéines de structure
  • l'apparition de phages

La durée totale de l'infection peut être estimée à 24 min. (de la fixation à l'apparition de phages complets)

3.2.2. phase 2 ou phase d'éclipse

Dans la phase 2 (définie par l'absence de phages dans la bactérie) on peut constater :

  • que des protéines virales apparaissent rapidement alors que le DNA bactérien est intact et que le DNA viral n'est pas repliqué. La transcription utilise soit une RNA polymérase dépendante apportée avec le virus (mais les protéines ne semblent pas pénétrer) ou celle de la cellule. La traduction utilise inévitablement la machinerie cellulaire (ribosomes, enzymes et autres facteurs protéiques...)
  • que dès l'apparition de ces protéines on peut constater la replication du DNA viral : une de ces protéines est une DNA polymérase DNA dépendante virale.
  • que le DNA bactérien est rapidement hydrolysé : on peut supposer l'apparition d'une DNAse virale.
  • que les protéines de structure apparaissent

3.2.3. phase 3

Dans la phase 3 commencent à apparaitre les phages : les structures fabriquées auparavant s'assemblent.

3.3. Étape : phase d'explosion

À la fin de la formation des phages, la bactérie est lysée et libère les phages.

3.4. Bilan

<schéma d'ensemble>

 

 

 

4. la lysogénie (cas du phage l)

Expérience : On irradie une culture d'E. coli K12 par les UV.
Un étalement de la culture montre des plages de lyse dans lesquelles on peut mettre en évidence un phage appelé l. Ce phage est "né" à cause de l'irradiation.

La lyse des E coli K12 utilisés au départ ne montre aucun virion : le virus ne persiste donc pas dans certaines bactéries sous la forme de virus.

Si l'on traite la culture initiale par des anticorps anti l on élimine tout virion extérieur. Pourtant le phénomène persiste : le phage est donc bien pourtant à l'intérieur de la bactérie.

On a pu montrer que le virus est à l'état de prophage sous forme intégrée au DNA bactérien et possède les mêmes propriétés pour la réplication : le virus se multiplie donc en même temps que la bactérie… Le phage est dit phage TEMPÉRÉ.

Le DNA n'est pas exprimé car un RÉPRESSEUR viral l'en empêche. Ce répresseur est transcrit mais bloque la suite de la transcription du DNA viral.

L'infection résulte donc d'une mutation entraînant une perte d'affinité du répresseur pour le DNA viral.

Un mécanisme complexe de régulation expliquerait la possibilité d'une infection non lytique chez une bactérie ne possédant pas le prophage, puisque celles qui le possèdent, contenant le répresseur, l'infection ne peut qu'être abortive (état d'immunité)

L'intégration du DNA se fait par des bouts collants : un enzyme de restriction coupe le DNA bactérien en laissant des bouts collants spécifiques que l'on retrouve aux extrémités du DNA viral.

 

Remarques :

Il existe des phages filamenteux à DNA simple brin (6,4 kbases) de 6,5 nm sur 900 nm, s'adsorbant au sommet du pili sexuel, se repliquant dans la cellule hôte grâce à la DNA polymérase bactérienne, et sortant de la cellule par un canal membranaire formé par des protéines virales. La cellule bactérienne ne semble pas affectée par cette infection particulière. Ex. de phages : fd,fl et M13 chez E. coli (famille des Inoviridae).

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