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Laboratoire

Les techniques de laboratoires utilisées en mycologie


L'identification des champignons est avant tout une identification morphologique. Ce n'est que pour les levures que l'étude des voies métaboliques permet d'affiner l'identification selon des techniques très proches de celles de la bactériologie.

1.Examen direct du produit pathologique et isolement des champignons pathogènes

1.1 Les produits pathologiques concernés

Tous les produits pathologiques classiques sont concernés par d'éventuels champignons. Leur prélèvement ne pose donc pas d'autres problèmes que ceux évoqués pour la Bactériologie sauf pour le sang qui peut être éventuellement ensemencé en Bouillon de Sabouraud citraté.
Seuls les prélèvements cutanés ou de phanères sont un peu particuliers :

- peau partant en lambeaux (squames) :

  • prélèvement à la périphérie des lésions avec un bistouri ou vaccinostyle ou curette
  • prélèvement avec la technique du carré de moquette (laine stérile) : la moquette est frottée sur les lésions puis reportée sur un milieu approprié.
    La technique du carré de moquette est une « nouvelle » méthode simple de prélèvement dans les mycoses superficielles; elle consiste à frotter la totalité de la surface à examiner (peau glabre, cuir chevelu) à l'aide d'un carré de tapis de laine (moquette) préalablement lavé, séché et stérilisé à l'autoclave. Le fragment de tapis après contact avec les lésions mycosiques, est appliqué sur la surface des boîtes de Pétri, contenant les milieux appropriés, et ensuite retiré.
    Le carré de moquette peut être remplacé par un carré de velours auto-adhésif ("Venilia", matériel utilisé en microbiologie pour réaliser des répliques de culture), stérilisé sous lumière ultraviolette et ensachés dans du papier sulfurisé.
  • prélèvement à l'aide de cellophane adhésive (pour Pityriasis versicolor)

- cheveux, poils :

  • choisir bien entendu les phanères malades, éventuellement sous lumière UV (lampe de Wood avec les cheveux fluorescents. Les arracher au lieu de l'infection à l'aide d'une pince stérile.
  • prélever au carré de moquette.
            

- ongles :

racler l'ongle à la curette

  • En cas d'onyxis, on grattera la partie lésée avec le tranchant d'un bistouri. On est parfois obligé de meuler l'ongle pour arriver à la zone lésée. Il faut prélever au niveau de la jonction partie saine-partie pathologique. L'atteinte du bout des ongles oriente les recherches vers les dermatophytes; l'atteinte de la base vers Candida albicans, dans ce cas il y a périonyxis.
  • En cas de périonyxis (le plus souvent dû à un champignon du genre Candida), s'il existe un écoulement, presser la région et prélever à la pipette stérile. Sinon on écouvillonne avec force la région atteinte.

Le prélèvement est bien entendu l'acte essentiel : il faut qu'il soit réalisé avec soin pour être efficace.

1.2 Examen direct - problèmes posés par certains prélèvements

L'examen direct peut être fait avec :

  • état frais de préférence au contraste de phase
  • état frais au bleu coton colorant vital (augmentation du contraste)
  • état frais à l'encre de Chine (capsule de Cryptococcus neoformans)
  • Giemsa
  • Gram
  • etc. ?

L'examen direct permet une orientation du diagnostic grâce aux éléments parasitaires mis en évidence. Pour les champignons éventuellement commensaux comme les levures, on prendra garde à bien évaluer le nombre d'éléments vus à l'examen direct : la conclusion en dépend puisque les levures peuvent être commensales. Il faudra veiller à bien distinguer des filaments de chaînes de blastospores.
Dans le cas des prélèvements contenant de la kératine (poils, ongles ?), on traite par la potasse ou le lactophénol pour éclaircir.

1.3 L'isolement

Il met en jeu :

  • un milieu de culture adapté : la gélose SABOURAUD contenant une base peptonée additionnée de glucose, milieu convenant donc aux bactéries qui peuvent toutefois être inhibé par un pH acide (hydrolysant parfois l'agar...). Les champignons cultivent bien sûr sur gélose ordinaire.?
    Ce milieu est souvent conditionné en tubes plutôt qu'en boite afin d'éviter la dessication.
  • des additifs sélectifs éventuels :
    • Antibiotiques antibactériens pour éliminer la flore bactérienne contaminante (Chloramphénicol, Gentamicine ou les deux)
    • Un antibiotique actif sur les champignons commensaux ou saprophytes : l'actidione (cycloheximide) qui peut toutefois inhiber des champignons pathogènes.
  • une température d'incubation adaptée : les champignons apprécient souvent une température modérée de 30°C. Selon le prélèvement il faudra :
    • pour les mycoses profondes : 37°C (ce qui éliminera les saprophytes)
    • pour les mycoses superficielles : 27-30°C ce qui correspond à la température de la peau ou des phanères concernés.
  • une durée d'incubation suffisante, à un taux d'humidité adéquate :
    • 1 à 2 jours pour les Levure
    • 1 à 4 jours pour les Moisissures
    • 3 à 15 jours pour les Dermatophytes

En conséquence, le milieu sera conditionné de préférence en TUBE.

En bactériologie :

on doit prendre garde à l'éventualité de la découverte de Levures en particulier sur un milieu d'isolement en BACTÉRIOLOGIE. Le produit pathologique doit être examinée en ce sens et l'isolement sur Sabouraud pratiqué en fonction de l'examen direct.

Problèmes de sécurité

Au niveau de la sécurité de la manipulation il faut bien dire que les champignons ne sont, en règle générale, pas dangereux pour le manipulateur. Leur dissémination par les spores (conidies) impose de bien faire attention au moment du prélèvement car les spores ont une fâcheuse tendance à tomber de la spatule : il suffira donc de regarder et de désinfecter en cas de contamination de la paillasse. Par contre, les tubes ensemencés ne posent aucun problème : les champignons ne sautent pas de tubes en tubes !!!
Certains préconisent l'utilisation d'un PSM : je ne pense pas qu'un tel outil soit d'une quelconque utilité dans la mesure où les spores ne "volent" pas vers les poumons du laborantin, et qu'en tout état de cause la probabilité de l'infection, à moins de le faire exprès, est aussi grande que celle d'une météorite frappant le tube. L'excès de précaution que représente le PSM met en exergue un danger imaginaire : commençons par une analyse de risque avant d'imposer des mesures de ce genre.
Le plus important au laboratoire n'est pas de séparer mycologie et bactériologie mais de prendre les mesures d'hygiène normale en permanence : désinfection des paillasses (évidemment !), désinfection simple des étuves (par exemple en passant une chiffonette imbibée d'éthanol). Dans ces conditions, les Aspergillus mis dans l'étuve de bactériologie à 37°C ne vont pas sur les boîtes de géloses, même Chocolat enrichie.

1.4 Coupes histologiques

La coloration par l'hématoxyline-éosine utile pour localiser les lésions inflammatoires ne facilite pas l'observation des éléments fongiques habituellement mal colorés par cette technique. Par contre la technique de Hotchkiss-Mac Manus colore intensément la paroi polyosidique de tous les champignons et permet un diagnostic rapide.
L'imprégnation argentique (technique de Gromori modifiée par Grocott) permet également de reconnaître facilement les champignons dans les tissus, la paroi fongique étant intensément colorée en noir par l'argent.

L'examen histopathologique est très utile au diagnostic d'une mycose. Les lésions des mycoses revêtent souvent l'allure d'inflammations aiguës, subaiguës ou chroniques des plus banales. D'autres lésions sont en revanche très évocatrices et permettent de porter d'emblée un diagnostic (inflammation nodulaire pseudotumorale des mycétomes).
Le diagnostic histopathologique est fréquemment un élément d'orientation, mais il arrive qu'il soit décisif à lui seul.
Cet examen est souvent indispensable pour prouver le rôle pathogène d'un champignon habituellement saprophyte.


2.Identification des champignons pathogènes

2.1 L'examen macroscopique des colonies

Deux types de milieux, parfois même deux milieux "identiques" mais de marques différentes?, apportent une meilleure approche : un milieu de Sabouraud et un milieu à l'extrait de malt.
De nouveaux milieux chromogéniques apparaissent : des substrats particuliers permettent la mise en évidence directe d’enzymes, en particulier d’une béta-galactosaminidase, qui hydrolyse un hétéroside constitué de béta-D-NAcétyl-Galactosamide lié à un chromogène. Voir la documentation bioMérieux sur le milieu chromogénique commercialisé.
L'examen macroscopique permet de distinguer :

les colonies de type bactérie :

Il s'agit en général de colonies de levures ne présentant pas de particularités par rapport aux colonies bactériennes hormis éventuellement une pigmentation (Rhodotorula)
Sur milieu chromogénique, les colonies bleues sont des Candida albicans (le plus souvent, mais comme elles ne sont alors pas identifiées, les faux positifs ne sont pas détectés. On ne peut donc que faire confiance aux fabricants).

les colonies filamenteuses :

Pour les champignons filamenteux, l'identification macroscopique est un acte essentiel.
On doit noter :

critères exemples
la vitesse de croissance nombre de jours pour obtenir une culture (1, 2, une semaine, deux à trois semaines). La date d'ensemencement doit donc être mentionnée sur le tube.
l'aspect de la colonie en surface et la forme de la colonie
type bactérienne ou filamenteuse, duvet, acumination centrale, vermiculé, poudreuse, plissée, granuleuse, centre déprimé, centre en cratère, cérébriforme, en coupole, astéroïdes, étoilée
la couleur de la colonie au recto
blanc, jaune, rouille, chamois ± clair, gris verdâtre, beige, violet, cireuse, ocre, jaune, rosée…
l'aspect de la colonie au verso (en revers)
noter la couleur du revers …

ATTENTION : les champignons donnent souvent un duvet informe : C'est le pléomorphisme malheureusement très fréquent, qui empêche toute identification.

Un exemple de macroscopie : tubes de moisissures


Penicillium, Aspergilllus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Rhizopus

2.2 Tests microscopiques après isolement

examen direct

Comme à l'examen direct du produit pathologique, l'état frais (éventuellement au bleu coton pour améliorer le contraste) permettra une orientation de l'identification ou une identification en lien avec la macroscopie.
Pour les filamenteux, cet examen doit absolument prélever le mycélium sans le casser pour voir les fructifications.

On peut utiliser

  • la technique du drapeau (ruban adhésif placé sur la palette de prélèvement qui sert à prendre, par la partie collante, le champignons à sa surface),
  • la culture sur lame (une lamelle déposée à la surface de l'ensemencement autorise une vision directe)
  • ou réaliser un prélèvement large incluant de la gélose.
Dans tous les cas, il faut veiller à ne pas disséminer les spores et désinfecter par exemple le microscope !

test de la blastèse (production de tubes germinatifs)

Certaines levures du groupe des Candida albicans présentent la particularité de former des tubes germinatifs, tubes ressemblant à un mycélium mais sans cloisonnement entre la levure et le filament., quand on les place

  • dans du sérum pendant 1 à 3 heures à 37°C
  • suspension en milieu pour la blastèse (Diagnostics Pasteur devenue Biorad)

Ces tubes germinatifs seraient représentatifs de la capacité invasive de C. albicans. Les autres levures ne le font pas.

Test de blastèse (Candida albicans)

recherche des chlamydospores

Certaines levures du groupe des Candida albicans présentent la particularité de former des Chlamydospores et un pseudomycélium quand elles sont cultivées sur milieu PAUVRES :

  • PCB (Pomme de Terre Carotte Bile, DIAGNOSTICS PASTEUR) ou
  • RAT (Riz Agar Tween bioMérieux) qui n'est plus commercialisé depuis 2001. Solution de remplacement : cliquez.

Les chlamydospores sont des spores rondes, généralement réfringentes, situées aux extrémités du pseudomycélium. Leur rôle est inconnu car il n'est pas sûr qu'elles puissent redonner des levures.
ATTENTION les milieux doivent être incubés à 30°C durant 48 heures (ce qui rend le test sans intérêt en microbiologie médicale).

 

Chlamydospores (Candida albicans)

 

 recherche de capsule (état frais à l'Encre de Chine (India ink))

Cryptococcus neoformans (Filobasidiella neoformans) à l'encre de Chine

2.3 Tests biochimiques après isolement

Ces tests ne concernent pratiquement que les LEVURES.
Ils étaient explorés à l'aide de tubes ou de boîtes. Aujourd'hui de très nombreuses minigaleries permettent une approche beaucoup plus précise et beaucoup plus simple des différentes levures. Les différents tests sont :

le zymogramme

Le zymogramme est l'étude de la fermentation des glucides.
Il peut être réalisé en tube de milieu CTA régénéré additionné de glucide et ensemencé par piqûre centrale d'une souche absolument pure. Le glucide peut être apporté sous la forme de disque imprégné ou d'une solution. La lecture semble être la production de gaz et non l'acidification mais les choses ne sont pas claires (à mon sens acidification d'abord).
Il peut aussi être une cupule de la galerie API20 C.
Le zymogramme est donc la liste des glucides fermentés ou non par la levure ou le champignon.

l'auxanogramme

L'auxanogramme est l'étude de l'utilisation comme seule source de carbone pour la croissance d'une molécule carbonée ajoutée à un milieu contenant les ions minéraux, les coenzymes (vitamines), les bases azotées et acides aminés indispensables à la croissance. Les molécules carbonées utilisées comme facteurs de croissance ne permettent pas une croissance visible. Elle peut être utilisée pour les bactéries et non seulement pour les Champignons (API20NE, API32 GN).

technique en boîte

Réaliser une suspension de la culture de levure : 2 anses dans 1 cm3.
En boîte, la culture est ensuite :
soit directement incorporée dans le milieu pour auxanogramme puis coulée en boîte (technique la plus efficace)
soit 0,1 mL sont étalés à la surface la boîte.
On ajoute ensuite des disques préimprégnés de molécules carbonées diverses (glucides mais aussi acides organiques ?). Après séjour à l'étuve, la culture microbienne est appréciée par lecture autour des disques : présence ou non de colonies. Veillez à vérifier la pureté de la souche ?

technique API Auxanogramme

La technique est similaire. Le milieu ensemencé est placé dans des cupules qui contiennent le substrat. On apprécie la culture ou non de la souche en référence à un témoin sans carbone suffisant pour assurer la culture.

d'autres tests

Des tests biochimiques classiques de la bactériologie peuvent être pratiqués. Par exemple :

  • recherche de l'URÉASE obligatoire sur une levure isolée du LCR
  • réduction du tétrazolium (TTC)
  • sensibilité à l'actidione (cycloheximide) à 0,1 % (100 µg/mL)
  • étude des besoins en facteurs de croissance (pour les filamenteux)

Les nouvelles galeries miniaturisées ajoutent :

  • la recherche de nombreuses aminopeptidases (Proline aminopeptidase, His aminopeptidase?)
  • la recherche d'une phénoloxydase assez caractéristique des basidiomycètes (Cryptococcus)
  • des enzymes de type ONPG hydrolase

 

minigaleries commercialisées

Les principales galeries sont présentées dans les pages spéciales accessibles ci-dessous :
EN TRAVAUX (Désolé mais cela tarde !)

Galerie API Candida Galerie Auxacolor Galerie FungiScreen      

2.4. tests immunologiques après isolement

recherche des Antigènes (immunofluorescence) capsulaires de Cryptococcus

ex : Ag capsulaires pour Cryptococcus
Il existe quatre sérotypes A,B,C,D. Or seuls les sérotypes A et D sont retrouvés chez les patients atteints de SIDA.
Il est possible de rechercher les Ag circulants par des particules de latex sensibilisés.

recherche des Antigènes (coagglutination) des Candida

Les laboratoires Fumouze développent des tests de coagglutination avec des particules sensibilisées par des Ac spécifiques pour l'identification :

  • de Candida albicans/dubliniensis
  • de Candida dubliniensis (distinction d'avec albicans)
  • de Candida kruzei

recherche des Anticorps

La recherche des anticorps est possible pour de nombreux champignons à l'aide d'Ag spécifiques.
La sérologie courante est utile pour le dépistage de certaines mycoses viscérales: aspergillose, candidose, histoplasmose, coccidioidomycose...
Les techniques utilisées sont: l'immunodiffusion en milieu gélifié (immunoélectrophorèse, électrosynérèse), l'hémagglutination indirecte, l'immunofluorescence, l'ELISA.
La sérologie reste encore du domaine de la recherche pour beaucoup de mycoses à caractère systémique.

3. Antibiogramme des champignons pathogènes

Les techniques utilisées pour les bactéries sont applicables aux champignons quand la recherche de la sensibilité a un intérêt (il existe des champignons constamment sensibles) c'est à dire dans le traitement des malades immunodéprimés.
Cet antibiogramme (ou antifongigramme) est très discuté quant à ses résultats.
Ces techniques sont :

  • la technique de diffusion en gélose
  • la technique de culture en cupules du champignon à deux concentrations critiques.

Quelques particularités :

  • le milieu utilisé peut être particulier en raison de particularités des antifongiques (milieu semi-synthétique pour la 5 fluorocytosine et les autres en routine, milieu complexe au casitone pour les polyènes et imidazolés car donnant lecture plus franche)
  • la durée d'incubation dépend du champignon.

Annexe 1 : Feuille de résultat en mycologie

 Cette feuille est issue d'un sujet de BTS de 1995. Elle permet de bien cerner les éléments à prendre en compte pour une bonne identification d'un champignon.

Contrôle de QUALITÉ : feuille de rendu de résultat

identification du tube de culture
                             
>

MÉTHODOLOGIE DU DIAGNOSTIC : Répondre dans un des deux tableaux ci-dessous en marquant dans les cases les caractères que vous avez utilisés pour le diagnostic :

CULTURE LEVURIFORME
CULTURE FILAMENTEUSE
ASPECT MACROSCOPIQUE
Culture lisse
1
 
Culture muqueuse coulante
2
 
Culture rugueuse membraneuse
3
 
Culture blanche à beige
4
 
Culture rose à rouge
5
 
ASPECT MICROSCOPIQUE SUR MILIEU D’ISOLEMENT
Levures
6
 
Levures avec capsule (examen à l’encre de Chine)
7
 
Levures avec mycélium ou pseudomycélium
8
 
Levures avec mycélium et arthrospores bourgeonnantes
9
 
Arthrospores bourgeonnantes avec levures et mycélium
10
 
MORPHOLOGIE SUR DES MILIEUX DIFFÉRENTS DE CEUX D’ISOLEMENT
sérum à 37°C présence d’une filamentation en 3-4 h.
11
 
SUR MILIEUX PCB, RAT OU AUTRES, À 25/27°C, PRÉSENCE DE :
levures seules
12
 
levures avec pseudomycélium
16
 
levures avec pseudomycélium et chlamydospores
14
 
Arthrospores non bourgeonnantes avec mycélium
15
 
Arthrospores bourgeonnantes avec levures et mycélium
16
 
CARACTÈRES BIOCHIMIQUES ET PHYSIOLOGIQUES
Absence de pousse sur actidione en 24 h.
17
 
Réduction du tétrazolium, rouge à violet , en 24 h
18
 
Présence d’un uréase en 4 h
19
 
ASSIMILATION DES GLUCIDES
maltose
20
 
lactose
21
 
inositol
22
 
tréhalose
23
 
raffinose
24
 
saccharose
25
 
FERMENTATION DES GLUCIDES
glucose
26
 
maltose
27
 
saccharose
28
 
tréhalose
29
 
ASPECTS ET FORMATIONS DIVERSES
filaments non septés
21
     
filaments en "buisson", en bambou
22
     
vrilles ou spires
23
     
chandeliers
24
     
clous
25
     
TÊTE ASPERGILLAIRE PRÉSENTANT :
?une vésicule en massue
26
     
?une rangée de phialides
27
     
?deux rangées de phialides
28
     
?un conidiophore court, brun, sinueux
29
     
?un conidiophore ponctué
30
     
Cleistothèce avec ascospores et/ou cellules en noisette
31
     
Pinceaux
32
     
Sporanges
33
     
INDIQUER LES MILIEUX
D’IDENTIFICATIONS UTILISÉS EN
METTANT UNE CROIX DANS LA CASE CORRESPONDANTE
         
API®
       
bioMérieux®
       
Pasteur Diagnostic
       
Roche®
       
Sobioda®
       
Autres à préciser
       
         
         
         
         
         
EXAMEN MACROSCOPIQUE
ASPECT
Glabre
1
 
Poudreux grain ± gros
2
 
Duveteux
3
 
RELIEF
Culture plissée
4
 
COULEUR DES COLONIES RECTO
Blanc à beige
5
 
Jaune vert à vert foncé
6
 
Gris- Brun - Noir
7
 
Autres (rose, violet, etc…)
8
 
COULEUR DES COLONIES VERSO
Jaune-orange
9
 
Rouge foncé à Brun
10
 
EXAMEN MICROSCOPIQUE
SPORES
MICROSPORES
Microspores rondes
11
 
Microspores piriformes ou ovales
12
 
Microspores échinulées à base tronquée
13
 
Microspores en chaînettes
14
 
MACROSPORES
Macrospores à paroi échinulée
15
 
Macrospores à paroi épaisse, extrémités effilées
16
 
Macrospores à paroi mince
17
 
Macrospores fusiformes arquées à logettes
18
 
AUTRES SPORES
Chlamydospores
19
 
Spores murales ou muriformes
20
 

 

 

 

 

 

 

 

 

Identification :

 

Identification :

 

COMMENTAIRES ÉVENTUELS

 

 

 


Annexe 2

Solution de remplacement pour le milieu RAT

Diverses solutions sont envisagées, expérimentées au Lycée VALIN de La Rochelle (information de Pierre CORNET) ou au lycée Paul Éluard de Saint Denis.

Milieu utilisé pour le concours de technicien de laboratoire spécialité C Session 2001 (publication par le SNAEN FEN)
  • crème de riz 10 g (en fait semoule de riz de marque Tipiak donnant un milieu assez trouble)
  • tween 80 : 10 mL
  • gélose 10 g
  • eau distillée qsp 1000 mL
Milieu utilisé à Saint Denis :
  • eau de cuisson du riz
  • gélose : 15 g pour 1 L

Ce milieu sans Tween80 a été testé en parallèle avec le même milieu additionné de tween. Les souches de Candida provenaient de bouches d'élèves, avec une souche test sûre de même provenance et conservée depuis quelques années. Les chlamydospores ont pu être observées en 24 heures.

Milieu commercialisé : chez BD-BBL (anciennement DIFCO) :

Rice Extract Agar, référence BD - 211567 au prix de 77 euros pour 100 g !

Bleu au lactophénol dit " bleu coton "

Composition pour 1 L :

  • Phénol 20 g
  • Acide lactique 20 g
  • Glycérol 40 g
  • Eau distillée 20 g
  • Bleu de méthyl 0,5 g
  • pH = 7,3

Bleu coton = bleu coton C4B = bleu de méthyle = bleu d’aniniline WS

Réaction au bleu de DIAZONIUM B (non testée)

  • culture en milieu de Sabouraud enrichi en extrait de levure à pH 7,0 en milieu liquide dans des tubes durant 2 à 3 jours
  • traitement du culot par KOK 50 mM 10 min. à ébullition
  • diluer directement par éthanol 0,95
  • éliminer l’éthanol par centrifugation
  • recouvrir de réactif DBB : réaction colorée en quelques secondes à une min.
Réactif
  • tris-HCl 0,25 M pH 7 0,15 mL
  • bleu de diazonium B 15 mg
  • à mélanger extemporanément sur glace et utiliser dans les minutes qui suivent.
  • fixation possible de la réaction colorée par l’éthanol
Résultats :
  • basidiomycètes : rouges à violet
  • ascomycètes : incolore à jaune.