Objet

À partir d'une suspension mono microbienne on procède à l'identification des bactéries Gram- oxydase. Si la suspension est polybactérienne, il faudra alors isolé sur une milieux sélectif des Gram- : Drigalski ou EMB.

1. Protocole d'orientation (Jour 1)

Rappel : Protocole à réaliser seulement à partir d'une souche mono bactérienne

2.1. Réalisation du Gram et de l'état frais (examen microscopique): 

Réaliser une coloration sur un frottis à partir d'une suspension ou d'une gélose sélective des Gram -. Pour la réalisation de la coloration se référer à la procédure M1001.

On observe alors des bacilles Gram – (parfois cocobacillaire), non sporulés.

Réaliser un état frais à partir de la suspension pour déterminer le mouvement et le groupement de l'espèce (cf protocole M1002)

2.2. Réalisation de de l'oxydase

Présence de bacilles gram -, il faut réaliser la recherche de l'enzyme : l'oxydase selon le protocole M2001.

Présence de coloration rose violacée: Oxydase+ 

Absence de coloration rose violacée : Oxydase -       (image de l'oxydase)

2.3 Orientation du premier jour et galerie d'identification

Bacilles Gram -, oxydase - , non exigeante. Donc on s'oriente vers la famille des ENTEROBACTERIACEAE et le genre Stenotrophomonas, Acinetobacter

On ensemence alors :

• Une gélose ordinaire pour déterminer l’exigence et la pureté de la souche.

• Une gélose viande foie pour le type respiratoire.

• Un milieu Hugh et Leifson pour la voie d'attaque du glucose.

• Un bouillon nitraté pour la recherche de la nitrate réductase

• Une galerie d'identification.

2. Protocole d'identification (Jour 2) 

2.1 Lecture des milieux

• Vérifier la pureté de la souche : S'assurer d'avoir un seul type de colonie sur la gélose ordinaire. Si la souche est pure la lecture des milieux et l'identification peut être réaliser.

• L'exigence de la bactérie : Les espèces Gram – les plus rencontrées sont essentiellement des souches non exigeantes.

• Le type respiratoire : Déterminer le type respiratoire selon le niveau et le lieu de la culture ( aérobie, anaérobie, aéro-anaérobie) 

  • Si la souche est aérobie anaérobie facultative : identification de la famille des ENTEROBACTERIACEAE.

    Si la souche est aérobie stricte : identification du genre Stenotrophomonas

• La voie d'attaque du glucose : Déterminer la voie d'attaque du glucose selon la couleur du milieu et la zone d'acidification

  

   

• La recherche la nitrate réductase : Lecture après l'ajout des réactifs N1 et N2. On observe une coloration rouge du milieu en cas de présence de l'enzyme. Si pas de coloration ajout du zinc. 

  

  NR+ NR-

• La lecture de la galerie miniaturisée (Api 20E) : lecture de la microgalerie et détermination de l'espèce soit à partir du tableau taxonomique ou un logiciel d'identification (il est nécessaire de confirmer l'identification numérique par une identification du technicien caractère par caractère).
  

2.2 Identification

Rendre l'identification :

          - identifier la famille ou le genre.

- identifier l’espèce

- antibiogramme

- conclure selon le cas clinique.

2.3 caractères antigéniques

Permet d'identifier précisément le sérovar et rendre une identification plus complète.

2012_01_13

ANCIENNE VERSION

Lycée Paul Éluard Avenue Jean Moulin 93206 SAINT DENIS	PROCÉDURE			RÉF : M5002
	Identification d'un bacille gram -  oxydase -			Création date Version : 1.2 Modification : date
Rédacteur : HACQUIN Laura		Vérificateur : jnj	Approbatrices :
Date : 2010_04_06		Date : Visa	Date : Visa

1. OBJET

Les bactéries gram - sont mise en évidence par la coloration de gram. Elles apparaissent rose au microscope. Cette coloration est déterminante dans la classification bacterienne.
L'oxydase est une enzyme. Ce test permet de mettre en évidence la présence ou non de cette enzyme par la bactérie.

 

 

 

 

2. DÉMARCHE

1. Examens microscopique:

• coloration de gram

• état frais

2. Examens macroscopiques:

• test enzymatique: on réalise l'oxydase car la bactérie est gram négatif.

 

3. BIBLIOGRAPHIE

http://fr.wikipedia.org/wiki/Gram_n%C3%A9gatif

http://fr.wikipedia.org/wiki/Oxydase

 

4. HISTORIQUE

(indiquer dans le tableau les modifications réalisées. Mettre les éléments avec le dernier en HAUT. Respectez le format de date : ANNEE_MOIS_JOUR)

DATES
2010_05_04	Modification par hacquin laura
2010_03_13	Création par hacquin laura

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