Lycée Paul Éluard | PROCÉDURE | RÉF : M1004 | ||
Coloration des BAAR en fluorescence(Méthode a l’auramine) | Création date : 2011_12_04
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Rédactrice : BHUNJUN K…
| Vérificateur : | Approbatrices : | ||
Date : Visa | Date : Visa | Date : Visa |
1. Principe
La coloration à l’auramine est une coloration en fluorescence, les BAAR (ou Bacilles Acido-Alcoolo Résistants) sont colorés en jaune-vert fluorescent sur fond rouge. Elle améliore la sensibilité de détection des BAAR mais manque de spécificité (faux positifs) : il faut donc obligatoirement confirme un résultat positif par une coloration de Ziehl ou de Kinyoun. Ce document aura pour but, de détaillé les différentes étapes du protocole de coloration et d’expliquer la lecture de l’examen microscopique des BAAR par la méthode a l’auramine.
2. Technique
2.1. Matériels nécessaires :
Pour la coloration :
Auramine |
Éthanol a 95% |
Phénol |
Eau bidistillée |
Mélanger ces 2 solutions.
Pour la décoloration :
Acide chlorhydrique |
Éthanol a 70% |
Pour la recoloration :
Rouge de thiazine |
Eau bistillée |
2.2 Mode opératoire
Préparation du matériel :
Graver sur la lame les références du prélèvements.
Réaliser un frottis fin sur les 2/3 de la lames
A partir du culot de centrifugation faire un frottis sur une surface d’environ 1cm x 2cm
Fixation du frottis :
Sécher le frottis sur plaque chauffante (ou a l’air).
Fixer via l’éthanol.
Coloration (selon la méthode de Degommier):
| Recouvrir le frottis de solution d’auramine pendant 15 à 20 minutes sans chauffer (ou 10 minutes après avoir chauffé) |
Rincer a l’eau du robinet | |
| -Recouvrir le frottis de solution d’acide alccol pendant 5 à 10 minutes |
-rincer | |
| -Recouvrir le frottis de rouge de thiazine phéniquée pendant 1.5 a 2 minutes |
-Rincer et sécher | |
-Observer au microscope a fluorescence |
2.3 Lecture du frottis :
La lecture se fait avec un microscope à fluorescence, de préférence dans une pièce sombre. Les BAAR apparaissent en vert/jaune brillant sur fond rouge orangé. Ceci permet une exploration rapide du frottis (3 à 5 minutes); la lecture peut se faire à faible grossissement : x25 pour un dépistage rapide et x40 pour confirmation. On doit observer au minimum 30 champs pour déclarer une lame négative (où il n'y a pas de BAAR).
2.4 Interprétation :
Nombres de BAAR par champs (grossissement x1000) | Interprétation |
<1/100 : | Négatif |
1-9/100+ | + : examen suspect à confirmer |
10-99/100 | ++ |
1-9 | +++ |
10-99 | ++++ |
>100 | +++++ |
Proposition de résultats par l’OMS.
exemple : image de coloration de BAAR en fluorescence
Historique des modifications de ce texte :
DATE : | Modifications apportées |
2011_12_04 | Création du texte |
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ANCIENNE VERSION
Lycée Paul Éluard | PROCÉDURE | RÉF : M1005 | ||
Coloration des BAAR en fluorescence | Création date | |||
Rédacteur : Froissart Laurine | Vérificateur : | Approbatrices : | ||
Date : 2010-03-23 Visa | Date : Visa | Date : Visa |
1. OBJET
BAAR : Bacilles Acido-Alcoolo RésistantsBacilles tuberculeux cultivant sur le milieu de Lowenstein-Jensen.
Ce document détaille le protocole de coloration et d'examens microscopiques des frottis colorés pour la recherche et l'observation des mycobactéries.
2. DÉMARCHE
PRÉPARATION DU FROTTIS1) Graver au diamant la référence du prélèvement sur la lame
2) À partir du prélèvement, réaliser un frottis fin sur les 2/3 de la lame
(le prélèvement doit être de préférence une parcelle purulente)
3) À partir du culot de centrifugation, faire un frottis sur une surface d'environ 1cm x 2cm
Remarque : si le frottis est réalisé à partir du flacon Bactec 12B, 0.1mL de culot est ajouté à 0.1mL de sérum de lapin.
FIXATION DU FROTTIS
1) Laisser sécher le frottis, à l'air ou sur plaque chauffante à température moyenne.
2) Fixer à l'alcool méthylique.
COLORATIONS
Nous utiliserons la coloration à l'auramine. L'auramine est un fluorochrome. C'est une coloration variante de Ziehl-Neelsen.
Voici la technique selon la méthode de Degommier :
1) Recouvrir la lame d'alcool méthylique : 2 minutes
2) Rincer à l'eau distillée
3) Recouvrir la lame d'auramine : 15 minutes
4) Rincer à l'eau distillée
5) Recouvrir la lame d'alcool acide : 5 minutes
6) Rincer à l'eau distilée
7) Recouvrir la lame de rouge de thiazine : 1 minute 30
8) Rincer à l'eau distillée
9) Recouvrir la lame d'alcool acide : 3 minutes
10) Rincer à l'eau distillée
11) Laisser sécher à l'air libre ou dans une étuve
Remarques : Il faut éviter de sécher le frottis avec du papier filtre, cela abimerait le frottis.
LECTURE DU FROTTIS
La lecture se fait avec un microscope à fluorescence, de préférence dans une pièce sombre. Les BAAR apparaissent en vert/jaune brillant sur fond rouge orangé. Ceci permet une exploration rapide du frottis (3 à 5 minutes); la lecture peut se faire à faible grossissement : x25 pour un dépistage rapide et x40 pour confirmation. On doit observer au minimum 30 champs pour déclarer une lame négative (où il n'y a pas de BAAR).
RESULTATS
Nombre de BAAR par champs | Résultats |
<1/100 | Négatif |
1-9/100 | + : examen suspect à confirmer |
10-99/100 | ++ |
1-9 | +++ |
10-99 | ++++ |
>100 | +++++ |
3. BIBLIOGRAPHIE
www.microbes-edu.org/professionel/GBEA/MO004.htmhttp://www.mycobacterie.fr/tech/coloration/auramine_colo.html
4. HISTORIQUE
(indiquer dans le tableau les modifications réalisées. Mettre les éléments avec le dernier en HAUT. Respectez le format de date : ANNEE_MOIS_JOUR)
DATES | |
2010_05_04 | modification par Laurine Froissart |
2010_04_06 | modification par Laurine Froissart |
2010_03_23 | Création par :laurine froissart |