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MAQ

Lycée Paul Éluard
Avenue Jean Moulin
93206 SAINT DENIS

PROCÉDURE

RÉF : M1004

Coloration des BAAR en fluorescence

(Méthode a l’auramine)

Création date : 2011_12_04


Version : 1.2
Modification : date

Rédactrice : BHUNJUN K…

 

Vérificateur :

Approbatrices :

Date : Visa

Date : Visa

Date : Visa

1. Principe

La coloration à l’auramine est une coloration en fluorescence, les BAAR (ou Bacilles Acido-Alcoolo Résistants) sont colorés en jaune-vert fluorescent sur fond rouge. Elle améliore la sensibilité de détection des BAAR mais manque de spécificité (faux positifs) : il faut donc obligatoirement confirme un résultat positif par une coloration de Ziehl ou de Kinyoun. Ce document aura pour but, de détaillé les différentes étapes du protocole de coloration et d’expliquer la lecture de l’examen microscopique des BAAR par la méthode a l’auramine.

2. Technique

2.1. Matériels nécessaires :

Pour la coloration :

Auramine

Éthanol a 95%

 

Phénol

Eau bidistillée

Mélanger ces 2 solutions.

Pour la décoloration :

Acide chlorhydrique

Éthanol a 70%

Pour la recoloration :

Rouge de thiazine

Eau bistillée

2.2 Mode opératoire

Préparation du matériel :

  • Graver sur la lame les références du prélèvements.

  • Réaliser un frottis fin sur les 2/3 de la lames

  • A partir du culot de centrifugation faire un frottis sur une surface d’environ 1cm x 2cm

Fixation du frottis :

  • Sécher le frottis sur plaque chauffante (ou a l’air).

  • Fixer via l’éthanol.

Coloration (selon la méthode de Degommier):


Coloration

Recouvrir le frottis de solution d’auramine pendant 15 à 20 minutes sans chauffer (ou 10 minutes après avoir chauffé)

Rincer a l’eau du robinet


Décoloration

-Recouvrir le frottis de solution d’acide alccol pendant 5 à 10 minutes

-rincer



Recoloration

-Recouvrir le frottis de rouge de thiazine phéniquée pendant 1.5 a 2 minutes

-Rincer et sécher

-Observer au microscope a fluorescence

2.3 Lecture du frottis :

La lecture se fait avec un microscope à fluorescence, de préférence dans une pièce sombre. Les BAAR apparaissent en vert/jaune brillant sur fond rouge orangé. Ceci permet une exploration rapide du frottis (3 à 5 minutes); la lecture peut se faire à faible grossissement : x25 pour un dépistage rapide et x40 pour confirmation. On doit observer au minimum 30 champs pour déclarer une lame négative (où il n'y a pas de BAAR).



2.4 Interprétation :


Nombres de BAAR par champs (grossissement x1000)

Interprétation

<1/100 :

Négatif

1-9/100+

+ : examen suspect à confirmer

10-99/100

++

1-9

+++

10-99

++++

>100

+++++

Proposition de résultats par l’OMS.

 

exemple : image de coloration de BAAR en fluorescence

 

 

 





Historique des modifications de ce texte :

DATE :

Modifications apportées

2011_12_04

Création du texte








ANCIENNE VERSION  

Lycée Paul Éluard
Avenue Jean Moulin
93206 SAINT DENIS

PROCÉDURE

RÉF : M1005

Coloration des BAAR en fluorescence

Création date
Version : 1.2
Modification : date

Rédacteur : Froissart Laurine

Vérificateur :

Approbatrices :

Date : 2010-03-23 Visa

Date : Visa

Date : Visa

1. OBJET

BAAR : Bacilles Acido-Alcoolo Résistants
Bacilles tuberculeux cultivant sur le milieu de Lowenstein-Jensen.
Ce document détaille le protocole de coloration et d'examens microscopiques des frottis colorés pour la recherche et l'observation des mycobactéries.

2. DÉMARCHE

PRÉPARATION DU FROTTIS
1) Graver au diamant la référence du prélèvement sur la lame
2) À partir du prélèvement, réaliser un frottis fin sur les 2/3 de la lame
(le prélèvement doit être de préférence une parcelle purulente)
3) À partir du culot de centrifugation, faire un frottis sur une surface d'environ 1cm x 2cm

Remarque : si le frottis est réalisé à partir du flacon Bactec 12B, 0.1mL de culot est ajouté à 0.1mL de sérum de lapin.

FIXATION DU FROTTIS
1) Laisser sécher le frottis, à l'air ou sur plaque chauffante à température moyenne.
2) Fixer à l'alcool méthylique.

COLORATIONS
Nous utiliserons la coloration à l'auramine. L'auramine est un fluorochrome. C'est une coloration variante de Ziehl-Neelsen.
Voici la technique selon la méthode de Degommier :
1) Recouvrir la lame d'alcool méthylique : 2 minutes
2) Rincer à l'eau distillée
3) Recouvrir la lame d'auramine : 15 minutes
4) Rincer à l'eau distillée
5) Recouvrir la lame d'alcool acide : 5 minutes
6) Rincer à l'eau distilée
7) Recouvrir la lame de rouge de thiazine : 1 minute 30
8) Rincer à l'eau distillée
9) Recouvrir la lame d'alcool acide : 3 minutes
10) Rincer à l'eau distillée
11) Laisser sécher à l'air libre ou dans une étuve

Remarques : Il faut éviter de sécher le frottis avec du papier filtre, cela abimerait le frottis.

LECTURE DU FROTTIS
La lecture se fait avec un microscope à fluorescence, de préférence dans une pièce sombre. Les BAAR apparaissent en vert/jaune brillant sur fond rouge orangé. Ceci permet une exploration rapide du frottis (3 à 5 minutes); la lecture peut se faire à faible grossissement : x25 pour un dépistage rapide et x40 pour confirmation. On doit observer au minimum 30 champs pour déclarer une lame négative (où il n'y a pas de BAAR).

RESULTATS
Nombre de BAAR par champsRésultats
<1/100Négatif
1-9/100+ : examen suspect à confirmer
10-99/100++
1-9+++
10-99++++
>100+++++
propositions de résultats par l'OMS, ave un grossissement x1000.

3. BIBLIOGRAPHIE

www.microbes-edu.org/professionel/GBEA/MO004.htm
 http://www.mycobacterie.fr/tech/coloration/auramine_colo.html

4. HISTORIQUE

(indiquer dans le tableau les modifications réalisées. Mettre les éléments avec le dernier en HAUT. Respectez le format de date : ANNEE_MOIS_JOUR)

DATES 
  
2010_05_04modification par Laurine Froissart
2010_04_06modification par Laurine Froissart
2010_03_23Création par :laurine froissart